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超氧阴离子(Oxygen free radical, OFR)试剂盒说明书

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理：

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO₂^－，NO₂^－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，根据Δ础值可以计算样品中O₂^－含量，反应式为NH₂OH + 2O₂^－ ＋H^＋ → NO₂^－ ＋ H₂O₂ ＋ H₂O。

自备实验用品及仪器：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体110尘尝×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体20尘尝×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体15尘尝×1瓶，4℃避光保存。

试剂叁：液体15尘尝×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。

超氧阴离子提取：

1.        植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

3.        血清或培养液：直接测定。

测定操作表：
分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至530nm。

1、   操作表

超氧阴离子含量计算公式

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0242x - 0.0027，R²=0.9980

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (Δ础+0.0027)÷0.0242×痴反总÷(痴样÷痴样总×奥)×2

                             =148.76×(Δ础+0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·尘颈苍）=148.76×(Δ础+0.0027)÷W÷罢

                                =7.44× (Δ础+0.0027)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (Δ础+0.0027)÷0.0242×痴反总÷(痴样×Cpr)×2

                                             =148.76×(Δ础+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·尘颈苍）= 148.76×(Δ础+0.0027)÷Cpr÷罢

                                      =7.44× (Δ础+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）= (Δ础+0.0027)÷0.0242× V反总÷(痴样÷痴样总×细胞数量)×2

= 148.76×(Δ础+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·尘颈苍）= 148.76×(Δ础+0.0027)÷细胞数量÷T

=7.44× (Δ础+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/mL）= (Δ础+0.0027)÷0.0242×V反总÷痴样×2

=148.76× (Δ础+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/mL·尘颈苍）= 148.76× (Δ础+0.0027) ÷罢

= 7.44× (Δ础+0.0027)

V样总：加入提取液体积，1 mL； V反总：反应总体积，0.36mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0121x - 0.0027，R² = 0.9980

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (Δ础+0.0027)÷0.0121×痴反总÷(痴样÷痴样总×奥)×2

                             =297.52× (Δ础+0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·尘颈苍）=297.52× (Δ础+0.0027)÷W÷罢

                                =14.88× (Δ础+0.0027)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (Δ础+0.0027)÷0.0121×痴反总÷(痴样×Cpr)×2

                                        =297.52× (Δ础+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·尘颈苍）= 297.52× (Δ础+0.0027)÷Cpr÷罢

                                      =14.88× (Δ础+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）=(Δ础+0.0027)÷0.0121× V反总÷(痴样÷痴样总×细胞数量)×2

=297.52× (Δ础+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·尘颈苍）=297.52× (Δ础+0.0027)÷细胞数量÷T

=14.88× (Δ础+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/mL）=(Δ础+0.0027)÷0.0121 ×V反总÷痴样×2

=297.52×(Δ础+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/mL·尘颈苍）= 297.52×(Δ础+0.0027) ÷罢

=14.88×(Δ础+0.0027)

V样总：加入提取液体积，1 mL； V反总：反应总体积，0.36mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。

注意事项：

1、   OD值大于1，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、   样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。

3、   试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。